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链霉菌Snea253杀线虫活性产物的代谢调控及微生态影响研究

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作者:
朱峰
导师:
陈立杰
学科专业:
植物病理学 
文献出处:
沈阳农业大学 2016年
关键词:
委内瑞拉链霉菌论文  杀线虫活性产物论文  代谢调控论文  高通量测序论文  微生态生境论文  

摘要:委内瑞拉链霉菌Snea253菌株具有杀线虫活性,但是其代谢产物可能是以难分离的水溶性氨基糖类化合物为主。因此,本研究从营养代谢调控和基因代谢调控的角度研究影响其活性物质产率的关键因子,为该生物杀线剂的研发和产业化奠定理论基础。同时,研究Snea253发酵液的施用对土壤微生态环境的影响,确定其环境安全性。具体研究结果如下:1. Snea253碳氮源的营养代谢调控研究:利用Plackeet-Burman和Box-Benhnken试验设计方法,获得最佳的碳氮源营养培养基:4%可溶性淀粉,3%葡萄糖,3.5%花生饼粉,0.3%(NH4)2SO4,0.04%NaCl,0.02%K2HPO4,0.02%MgSO4·H2O,0.00125%FeSO4。营养代谢调控后的Snea253发酵液杀线虫活性为89.4%,比原始发酵液提高了26.3%。应用响应面法中心组合试验设计方法确定其最优发酵条件:72 h种龄、5%接种量、初始pH值6.6、发酵温度28℃、发酵时间5.25 d、摇床转速175 r/min和20%装液量。优化后的Snea253发酵液杀线虫活性为91.2%,比原始发酵液提高了29.7%。2. Snea253的基因代谢调控研究:利用RNA-Seq的De Novo方法研究了强毒株和弱毒菌株的转录组信息,筛选到两者间的差异表达基因3234个,其中2668个基因上调表达,566个基因下调表达。差异表达基因的GO分析显示,共有2160个DEGs注释到45个GO条目。通过KEGG数据库比对分析,共有2796个DEGs基因注释到161个Pathway,主要参与代谢通路、次级代谢产物生物合成、不同环境微生物代谢、核糖体以及淀粉和蔗糖代谢等通路。经过数据分析,筛选到了Snea253与碳氮代谢相关的8个基因,包括5个上调基因Unigene556_All、Unigene609_All、Unigene1016_All、Unigene989_All、Unigene1006_All和3个下调基因Unigenel272_All、Unigene1090_All、CL20.Contig2_All。结合Q-PCR试验验证了各基因的表达与RNA-Seq分析结果一致:与弱毒株相比,强毒株代谢调控相关基因上调最高的如Unigene556_All上调了22.86倍,最低的如Unigene1006_All也上调了3.48倍,而下调基因Unigenel272_All、Unigene1090_All和CL20.Contig2_All则分别下调了2.32倍、1.40倍和1.38倍。利用链霉菌表达载体plBl39,通过PEG介导的方法,成功构建了过表达菌株Snea253-Unigene556和Snea253-CL20.Contig2,基因的表达量分别比野生菌株提高1.68倍和2.16倍。3. Snea253处理对微生态生境中土壤线虫群落功能的影响:通过温室蔬菜的灌根试验发现,与对照相比,Snea253能够抑制土壤线虫的总数量、植物寄生线虫(PP)和食细菌线虫(BF)的数量,但抑制程度弱于阿维菌素处理,相反,捕食杂食性线虫(OP)数量显著增多。Snea253发酵液对植物寄生线虫(PP)和根结线虫Meloidogyne incognita的防治效果略低于阿维菌素的防治效果,但能有效的使PP和根结线虫的数量持续保持在较低的水平。Snea253处理土壤线虫的香农-威纳多样性指数(H’)多高于阿维菌素处理,而辛普森优势度指数(λ)多低于阿维菌素处理,说明,Snea253发酵液处理的土壤线虫群落多样性好于阿维菌素处理,优势种地位不突出、群落内物种数量分布较均匀。线虫区系分析和主成分分析发现,Snea253处理的土壤样品主要分布在了B象限,说明土壤养分状况较好而且受干扰程度较小,食物网稳定成熟。4. Snea253处理对微生态生境中土壤微生物群落功能的影响:利用高通量测序技术,检测了Snea253处理区土壤微生物群落的变化,发现土壤细菌群落有12个优势门、9个优势科和11个优势的属;而土壤真菌群落有6个优势门、9优势科和12个优势的属。与阿维菌素处理区相比,Snea253处理使细菌的最大优势类群变形菌门、黄单胞菌科、罗思河小杆菌属Rhodanobacter的丰富度显著增加,且与对照差异不显著;同样显著增加了真菌最大优势门子囊菌门、优势科火丝菌科、优势属Pseudaleuria和火丝菌科未定属Pyronemataceae的丰富度,以及增加了子囊菌门Ascomycota、第二大优势科粪壳菌目未定科Sordariales、优势属粪壳菌目未定属Sordariales的丰富度,且多与对照差异不显著。Biolog-Eco数据分析显示Snea253处理的平均颜色变化率(AWCD)值、Shannon多样性指数(H’)和McIntosh均匀度指数(U)显著高于阿维菌素处理,且与对照差异不显著,说明Snea253处理有利于土壤微生物群落对碳源的利用,群落多样性好,具有较好的均匀度。结合Biolog和高通量测序分析,明确了Snea253对土壤微生物群落是安全的,研究为Snea253的产业化利用提供了基础试验数据。

摘要

Abstract

第一章 植物线虫生防菌及微生态功能研究进展

1.1 设施蔬菜的发展及根结线虫病害的防治研究进展

1.1.1 我国设施蔬菜的发展概述

1.1.2 根结线虫病害防治的研究进展

1.2 委内瑞拉链霉菌的研究进展

1.2.1 委内瑞拉链霉菌产生的抗生素

1.2.2 链霉菌营养代谢调控研究进展

1.2.3 链霉菌代谢途径的基因调控研究进展

1.2.4 次生代谢途径改造

1.3 微生态生境中的生防菌功能研究进展

1.3.1 生防菌对土壤线虫多样性影响研究进展

1.3.2 生防菌对土壤微生物多样性影响的研究进展

1.3.3 土壤线虫和微生物多样性研究方法

1.4 本研究的目的和意义

第二章 链霉菌Snea253杀线虫活性产物的营养代谢调控研究

2.1 材料

2.1.1 供试菌种

2.1.2 试验药剂

2.1.3 试验仪器

2.1.4 主要培养基

2.2 试验方法

2.2.1 菌种培养

2.2.2 种子培养

2.2.3 发酵培养

2.2.4 Snea253生物活性检测

2.2.5 培养基底物单因素试验设计

2.2.6 营养源单因素浓度筛选试验

2.2.7 Plackett-Burman试验设计

2.2.8 最陡爬坡试验

2.2.9 Box-Benhnken设计

2.3 结果与分析

2.3.1 营养源对Snea253菌株产杀线虫代谢物的影响

2.3.2 单因素系列浓度对Snea253菌株杀线虫活性产物的影响

2.3.3 Plackett-Burman试验设计结果

2.3.4 最陡爬坡试验结果

2.3.5 响应面分析法

2.3.6 验证试验

2.4 小结

第三章 响应面法优化生防菌Snea253的发酵条件研究

3.1 材料

3.1.1 供试菌种

3.1.2 试验药剂

3.1.3 试验仪器

3.1.4 主要培养基

3.2 试验方法

3.2.1 菌种培养

3.2.2 种子培养

3.2.3 发酵培养

3.2.4 Snea253生物活性检测

3.2.5 发酵条件单因素试验设计

3.2.6 发酵条件优化方法

3.3 结果与分析

3.3.1 Snea253发酵条件的单因素试验结果

3.3.2 Plackett-Burman试验设计

3.3.3 最陡爬坡试验

3.3.4 响应面分析法

3.3.5 验证试验

3.4 小结

第四章 RNA-Seq分析链霉菌Snea253杀线虫活性代谢产物的调控基因研究

4.1 材料

4.1.1 试验材料

4.1.2 主要试剂

4.1.3 主要仪器设备

4.2 试验方法

4.2.1 Total RNA提取及质量检测

4.2.2 文库构建

4.2.3 信息分析

4.2.4 Q-PCR验证

4.3 结果与分析

4.3.1 RNA提取质量的检测

4.3.2 转录组产量统计

4.3.3 测序组装结果分析

4.3.4 Unigene的功能注释

4.3.5 差异表达基因

4.3.6 差异表达基因的富集分析

4.3.7 碳代谢相关的基因分析

4.3.8 氮代谢相关的基因分析

4.3.9 Q-PCR验证结果

4.4 小结

第五章 Snea253代谢调控相关基因过表达菌株的构建

5.1 材料

5.1.1 菌种与质粒

5.1.2 主要仪器和试剂

5.2 试验方法

5.2.1 引物设计

5.2.2 链霉菌总DNA的提取

5.2.3 构建pGEM-目的基因的载体

5.2.4 表达载体pIB139-基因的构建

5.2.5 链霉菌的原生质体的制备

5.2.6 目的基因表达链霉菌株的获得

5.2.7 目的基因的Q-PCR检测

5.3 结果与分析

5.3.1 总DNA的提取

5.3.2 目的基因的扩增及载体pGEM-目的基因构建结果

5.3.3 表达载体pIB139-目的基因的构建结果

5.3.4 目的基因表达链霉菌的获得

5.3.5 Q-PCR结果

5.4 小结

第六章 链霉菌Snea253发酵液对微生态生境中土壤线虫多样性的影响

6.1 材料

6.1.1 试验药剂

6.1.2 主要培养基

6.2 试验方法

6.2.1 试验地的选择及试验小区划分

6.2.2 土壤理化性质测定方法

6.2.3 Snea253发酵液制备

6.2.4 土壤样品采集与灌根试验

6.2.5 线虫的分离及鉴定

6.2.6 线虫生态学指数及计算方法

6.2.7 数据统计分析

6.3 结果与分析

6.3.1 试验田土壤的化学性质测定结果

6.3.2 Snea253发酵液处理区的土壤线虫的鉴定及群落组成分析

6.3.3 Snea253发酵液对土壤线虫群落的影响

6.3.4 Snea253发酵液对土壤线虫生态指数的影响

6.4 小结

第七章 链霉菌Snea253发酵液对微生态生境中土壤微生物多样性的影响

7.1 材料

7.1.1 试验药剂

7.1.2 主要培养基

7.2 试验方法

7.2.1 试验地的选择及试验小区划分

7.2.2 Snea253发酵液制备

7.2.3 土壤样品采集与灌根试验

7.2.4 高通量测序分析

7.2.5 Biolog Eco分析

7.2.6 数据统计分析

7.3 结果与分析

7.3.1 高通量测序分析东北温室土壤细菌的鉴定结果

7.3.2 高通量测序分析东北温室土壤真菌的鉴定结果

7.3.3 Biolog-Eco方法检测土壤微生物群落的碳代谢活性

7.3.4 Snea253处理对土壤微生物群落功能多样性指数的影响

7.4 小结

第八章 结论与讨论

8.1 Snea253碳氮源的营养代谢调控研究

8.2 Snea253的基因代谢调控研究

8.3 Snea253发酵液对东北温室微生态生境中土壤线虫群落功能的影响

8.4 Snea253发酵液对东北温室微生态生境中土壤微生物群落功能的影响

8.5 本研究主要创新点

参考文献

致谢

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